考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)含量，考馬斯亮藍(lán)測(cè)蛋白

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1，考馬斯亮藍(lán)測(cè)蛋白
2，考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量
3，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的公式是什么
4，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品能否用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定為什么
5，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線
6，考馬斯亮藍(lán)測(cè)定固體物質(zhì)蛋白質(zhì)含量

1，考馬斯亮藍(lán)測(cè)蛋白

會(huì)的。不僅堿性氨基酸，去垢劑,如SDS，還有高濃度的緩沖液都會(huì)有影響。而且由于蛋白質(zhì)酸性，堿性氨基酸含量不同，即使蛋白質(zhì)濃度相同，所測(cè)出的值也會(huì)不同。

考馬斯亮藍(lán)測(cè)蛋白

2，考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

測(cè)OD值都是需要預(yù)先調(diào)零的，通常我們測(cè)蛋白含量的時(shí)候，會(huì)用考馬斯亮藍(lán)溶液不加蛋白，只加水或者buffer調(diào)零，這樣的話蛋白質(zhì)含量是O，OD595 是零。如果你用其他的溶液調(diào)零，蛋白質(zhì)含量是O，OD595 的讀數(shù)與你調(diào)零時(shí)用的溶液相關(guān)，沒有一個(gè)一定的值。

1．大量的去污劑如tritonx-100、sds等嚴(yán)重干擾測(cè)定。2．蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)g-250結(jié)合的反應(yīng)十分迅速，在2min左右反應(yīng)達(dá)到平衡；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。因此測(cè)定時(shí)，不可放置太長(zhǎng)時(shí)間，否則將使測(cè)定結(jié)果偏低。

考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

3，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的公式是什么

公式是根據(jù)測(cè)量結(jié)果自己算出來(lái)的：考馬斯亮藍(lán)比色法是由Bradford等人建立的1種測(cè)定微量蛋白質(zhì)的方法L5]，考馬斯亮藍(lán)所含疏水基團(tuán)在酸性條件下與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)具有親和力，通過(guò)疏水作用與蛋白質(zhì)相結(jié)合，形成的藍(lán)色蛋白質(zhì)一染料復(fù)合物，在595 nm處有最大吸光度，復(fù)合物1 h內(nèi)保持穩(wěn)定。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)一染料復(fù)合物在595nm處的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。測(cè)定時(shí)，用同一種標(biāo)準(zhǔn)蛋白（自己選，如牛血清白蛋白，所選的標(biāo)準(zhǔn)蛋白最好是純化的待測(cè)蛋白——但這是理想狀態(tài)，一般選擇氨基酸構(gòu)成與待測(cè)蛋白相近的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。否則將影響測(cè)定結(jié)果）配制成覆蓋待測(cè)樣品蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，然后加等量考馬斯亮藍(lán)G-250，混勻后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品的吸光值。并測(cè)定待測(cè)樣品（可稀釋成幾個(gè)不同濃度的樣品同時(shí)測(cè)）的吸光值。所有樣品重復(fù)測(cè)三次。最后以蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算出回歸方程。如Y=aX+b 讓后把待測(cè)樣品的吸光值代入回歸方程，算出待測(cè)樣品濃度。只要上數(shù)據(jù)庫(kù)一搜，這樣的論文多的是，要加強(qiáng)自學(xué)能力呀！——賺點(diǎn)分真辛苦！

考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的公式是什么

4，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品能否用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定為什么

考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)-染料結(jié)合的原理，定量的測(cè)定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法?？捡R斯亮藍(lán)G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色?？捡R斯亮藍(lán)G-250在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，最大光吸收在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在波長(zhǎng)為595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。

公式是根據(jù)測(cè)量結(jié)果自己算出來(lái)的：考馬斯亮藍(lán)比色法是由bradford等人建立的1種測(cè)定微量蛋白質(zhì)的方法l5]，考馬斯亮藍(lán)所含疏水基團(tuán)在酸性條件下與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)具有親和力，通過(guò)疏水作用與蛋白質(zhì)相結(jié)合，形成的藍(lán)色蛋白質(zhì)一染料復(fù)合物，在595 nm處有最大吸光度，復(fù)合物1 h內(nèi)保持穩(wěn)定。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)一染料復(fù)合物在595nm處的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。測(cè)定時(shí)，用同一種標(biāo)準(zhǔn)蛋白（自己選，如牛血清白蛋白，所選的標(biāo)準(zhǔn)蛋白最好是純化的待測(cè)蛋白——但這是理想狀態(tài)，一般選擇氨基酸構(gòu)成與待測(cè)蛋白相近的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。否則將影響測(cè)定結(jié)果）配制成覆蓋待測(cè)樣品蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，然后加等量考馬斯亮藍(lán)g-250，混勻后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品的吸光值。并測(cè)定待測(cè)樣品（可稀釋成幾個(gè)不同濃度的樣品同時(shí)測(cè)）的吸光值。所有樣品重復(fù)測(cè)三次。最后以蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算出回歸方程。如y=ax+b 讓后把待測(cè)樣品的吸光值代入回歸方程，算出待測(cè)樣品濃度。只要上數(shù)據(jù)庫(kù)一搜，這樣的論文多的是，要加強(qiáng)自學(xué)能力呀！——賺點(diǎn)分真辛苦！

5，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

一、原理考馬斯亮藍(lán)G-250（Coomassie G-250）是一種甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的藍(lán)色染料，在465nm處有最大吸收值?？捡R斯亮藍(lán)G-250能與蛋白質(zhì)通過(guò)范得華相互作用形成蛋白質(zhì)—考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物藍(lán)色溶液，引起該染料的最大吸收λmax的位置發(fā)生紅移，在595nm處有最大吸收值。由于蛋白質(zhì)—考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物在595nm處的光吸收遠(yuǎn)高于考馬斯亮藍(lán)在465nm處的光吸收，因此，可大大地提高蛋白質(zhì)的測(cè)定靈敏度。蛋白質(zhì)—考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物溶液顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。利用溶液顏色的差異進(jìn)行比色測(cè)定，適合于蛋白質(zhì)類的定量分析，尤其適合于稀有蛋白質(zhì)的微量分析。考馬斯亮藍(lán)G-250試劑呈色反應(yīng)顏色穩(wěn)定、靈敏度高，最低測(cè)試蛋白質(zhì)量在1ug左右。二、操作步驟 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定法分別取六只試管，其中一只加入1.0ml蒸餾水做空白，5只分別加入不同體積的濃度為100ug/ml牛血清清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，補(bǔ)充水到1.0ml。然后每只試管加入5.0ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，搖勻放置5min，在紫外-可見分光光度計(jì)595nm處測(cè)定吸光值。以A595吸光值為縱坐標(biāo)，牛血清清蛋白的ug數(shù)量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體操作見下表。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定加樣試劑空白 1 2 3 4 5 100ug/ml牛血清清蛋白/ml 1.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 牛血清清蛋白/ug 0 10 20 40 60 80 去離子水/ml 0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 考馬斯亮藍(lán)G-250試劑/ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 吸光值A(chǔ)595 2. 蛋白樣品配制濃度約100ug/ml的待測(cè)蛋白質(zhì)溶液。取一只試管加入1.0ml蒸餾水做空白，一支加入0.5ml待測(cè)蛋白質(zhì)溶液，補(bǔ)充水到1.0ml。然后每支試管加入5.0ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，搖勻放置5min后，在紫外-可見分光光度計(jì)595nm處測(cè)定吸光值。用測(cè)得的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相當(dāng)于牛血清清蛋白的ug數(shù)量，計(jì)算出待測(cè)蛋白質(zhì)的含量。在標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)樣品的測(cè)定時(shí)，為了減小誤差，每一個(gè)濃度的蛋白質(zhì)做3支平行管。 3.試劑配置 a.牛血清清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液結(jié)晶牛血清清蛋白或酪蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法標(biāo)定該蛋白質(zhì)的百分含量或者根據(jù)牛血清清蛋白的消光系數(shù)是6.6來(lái)計(jì)算其百分含量。然后根據(jù)該蛋白的純度配置成濃度為100 ug/ml的蛋白溶液。 b.考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml質(zhì)量濃度為0.85g/ml的磷酸，作為母液保存，使用時(shí)用水稀釋到1000ml。試劑的最終濃度為0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250、質(zhì)量濃度為0.085g/ml磷酸。

6，考馬斯亮藍(lán)測(cè)定固體物質(zhì)蛋白質(zhì)含量

實(shí)驗(yàn)十四考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量　　一、目的　　學(xué)習(xí)和掌握考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法?！　《⒃怼　】捡R斯亮藍(lán)G-250（Coomassie brilliant blue G-250）測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1 000μg／mL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定方法。　　二、材料、主要儀器和試劑　　1．實(shí)驗(yàn)材料　　新鮮綠豆芽　　2．主要儀器　?。?）分析天平、臺(tái)式天平　?。?）刻度吸管　?。?）具塞試管、試管架　?。?）研缽　　（5）離心機(jī)、離心管　?。?）燒杯、量筒　　（7）微量取樣器　?。?）分光光度計(jì)　　3．試劑　?。?）牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸餾水中，即為1 000μg／mL的原液?！　。?）蛋白試劑考馬斯亮藍(lán)G-250的配制：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1 000mL。此溶液在常溫下可放置一個(gè)月?！　。?）乙醇　?。?）磷酸（85％）　　四、操作步驟　　1．標(biāo)準(zhǔn)曲線制作　?。?）0~100μg／mL標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取6支10mL干凈的具塞試管，按表1取樣。蓋塞后，將各試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混合，放置2min后用1cm光經(jīng)的比色杯在595nm波長(zhǎng)下比色，記錄各管測(cè)定的光密度OD595nm，并做標(biāo)準(zhǔn)曲線?！　”? 低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作　　管號(hào)　　1　　2　　3　　4　　5　　6　　1 000μg／mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（mL）　　0　　0.02　　0.04　　0.06　　0.08　　0.10　　蒸餾水（mL）　　1.00　　0.98　　0.96　　0.94　　0.92　　0.90　　考馬斯亮藍(lán)G-250試劑（mL）　　5　　5　　5　　5　　5　　5　　蛋白質(zhì)含量（μg）　　0　　20　　40　　60　　80　　100　　OD595nm　?。?）0~1 000μg／mL標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：另取6支10mL具塞試管，按表2取樣。其余步驟同（1）操作，做出蛋白質(zhì)濃度為0~1 000μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。　　表2 高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作　　管號(hào)　　7　　8　　9　　10　　11　　12　　1 000μg／mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（mL）　　0　　0.2　　0.4　　0.6　　0.8　　1.0　　蒸餾水（mL）　　1.00　　0.8　　0.6　　0.4　　0.2　　0　　考馬斯亮藍(lán)G-250試劑（mL）　　5　　5　　5　　5　　5　　5　　蛋白質(zhì)含量（μg）　　0　　200　　400　　600　　800　　1 000　　OD595nm　　2．樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定　?。?）待測(cè)樣品制備：稱取新鮮綠豆芽下胚軸2g放入研缽中，加2mL蒸餾水研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管中，再用6mL蒸餾水分次洗滌研缽，洗滌液收集于同一離心管中，放置0.5~1h以充分提取，然后在4 000r/min離心20min，棄去沉淀，上清液轉(zhuǎn)入10mL容量瓶，并以蒸餾水定容至刻度，即得待測(cè)樣品提取液。　?。?）測(cè)定：另取2支10mL具塞試管，按下表取樣。吸取提取液0.1mL（做一重復(fù)），放入具塞刻度試管中，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑，充分混合，放置2min后用1cm光徑比色杯在595nm下比色，記錄光密度OD595nm，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測(cè)樣品提取液中蛋白質(zhì)的含量X（μg）。以標(biāo)準(zhǔn)曲線1號(hào)試管做空白?！　”? 待測(cè)液蛋白質(zhì)濃度測(cè)定　　管號(hào)　　13　　14　　蛋白質(zhì)待測(cè)樣品提取液（mL）　　0.1　　0.9　　5　　0.1　　0.9　　5　　蒸餾水（mL）　　考馬斯亮藍(lán)G-250試劑（mL）　　OD595nm　　蛋白質(zhì)含量（μg）　　五、結(jié)果計(jì)算　　X×　　提取液總體積（mL）　　樣品蛋白質(zhì)含量（μg / g鮮重）=　　測(cè)定時(shí)取樣體積（mL）　　樣品鮮重（g）　　式中：X為在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)含量（μg）?！　×?、附注　　1．Bradford法由于染色方法簡(jiǎn)單迅速，干擾物質(zhì)少，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。　　2．有些陽(yáng)離子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物質(zhì)不干擾測(cè)定，但大量的去污劑如TritonX-100、SDS等嚴(yán)重干擾測(cè)定?！　?．蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合的反應(yīng)十分迅速，在2min左右反應(yīng)達(dá)到平衡；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。因此測(cè)定時(shí)，不可放置太長(zhǎng)時(shí)間，否則將使測(cè)定結(jié)果偏低。　　七、思考題　　1．制作標(biāo)準(zhǔn)曲線及測(cè)定樣品時(shí)，為什么要將各試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混合？　　參考答案　　1．將各試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混合目的是使反應(yīng)充分，并且使整個(gè)反應(yīng)液均一，否則在比色測(cè)定時(shí)，結(jié)果會(huì)有較大偏差，使標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作不標(biāo)準(zhǔn)，后續(xù)的測(cè)定結(jié)果就不可靠。

首先所有使用玻璃器皿都要洗干凈。1、考馬斯亮藍(lán)應(yīng)在乙醇、磷酸介質(zhì)中盡量溶解充分。然后過(guò)濾定容搖勻。2、用固定的2個(gè)比色杯做標(biāo)準(zhǔn)空白比色杯固定，每次測(cè)完后用乙醇將測(cè)定a值的比色杯洗干凈。我測(cè)定的r值在0.9925到0.9986供你參考