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高效液相色譜儀原理,HPLCMSMS原理

來源:整理 時(shí)間:2023-08-22 18:54:34 編輯:智能門戶 手機(jī)版

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1,HPLCMSMS原理

HPLC是初分化合物,一級(jí)MS是對(duì)HPLC譜圖中的各峰進(jìn)行質(zhì)譜分析,二級(jí)MS是對(duì)一級(jí)MS中有疑問的峰進(jìn)行在一個(gè)解離分析以確定一級(jí)MS的不確定峰的結(jié)構(gòu)。
ms/ms代表二級(jí)質(zhì)譜,是將經(jīng)過第一次質(zhì)譜檢測(cè)的離子以某種方式碎裂后再進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

HPLCMSMS原理

2,高效液相色譜法

鹽析原理 :一些物質(zhì)比如蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度,以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。當(dāng)用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液,中性鹽對(duì)水分子的親和力大于蛋白質(zhì),于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時(shí),中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后,由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變,蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和,更加導(dǎo)致蛋白溶解度降低,使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。 鹽析 1.鹽析一般是指溶液中加入無機(jī)鹽類而使溶解的物質(zhì)析出的過程。如:加濃(NH4)2SO4使蛋白質(zhì)凝聚的過程。 2.向某些蛋白質(zhì)溶液中加入某些無機(jī)鹽溶液后,可以使蛋白質(zhì)凝聚而從溶液中析出,這種作用叫作鹽析。 3.把動(dòng)物脂肪或植物油與氫氧化鈉按一定比例放在皂化鍋內(nèi)攪拌加熱,反應(yīng)后形成的高級(jí)脂肪酸鈉、甘油、水形成混合物。往鍋內(nèi)加入食鹽顆粒,攪拌、靜置,使高級(jí)脂肪酸鈉與甘油、水分離,浮在液面。(該反應(yīng)用以制肥皂)

高效液相色譜法

3,高校液相色譜分離原理是什么

分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離,分離過程是一個(gè)分配平衡過程。高效液相色譜主要有4種,下面分別描述一下。1、液-固吸附色譜。固定相是固體吸附劑,它是根據(jù)物質(zhì)在固定相是吸附作用差異來分離的。吸附作用越強(qiáng),K值越大保留時(shí)間越長(zhǎng)。2、液-液分配色譜。顧名思義,它是將固定液涂在擔(dān)體上作為固定相的,它的分離原理與液液萃取的原理相同,從而服從分配定律。在固定液中溶解度大,K值大,保留時(shí)間長(zhǎng)3、離子交換色譜。是離子交換樹脂上可電離的離子與具有相同電荷的被測(cè)離子可逆交換,由于被測(cè)離子在不同交換劑上具有不同的親和力而使子分離,親和力越強(qiáng),K值越大保留時(shí)間越長(zhǎng)。4、排阻色譜。固定相是多孔凝膠,內(nèi)布孔隙,分子大于孔隙的不能進(jìn)入固定相,直接從表面流過,幾乎沒有保留,小分子的物質(zhì)可自由進(jìn)出孔隙完全不受排阻,保留時(shí)間長(zhǎng)。中等體積的分子介于兩種情況之間。分離順序只與分子的尺寸有關(guān)。對(duì)于反相色譜,極性越小的物質(zhì),流動(dòng)相的極性越大,保留時(shí)間越長(zhǎng)。極性越小的物質(zhì),流動(dòng)相的極性越小,保留時(shí)間越短。對(duì)于極性大的物質(zhì)來說,流動(dòng)相的極性對(duì)其保留時(shí)間影響較小,而正相色譜正好相反。高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography \ HPLC)又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支,以液體為流動(dòng)相,采用高壓輸液系統(tǒng),將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱,在柱內(nèi)各成分被分離后,進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應(yīng)用。
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高校液相色譜分離原理是什么

4,高效液相色譜儀器原理是什么

高效液相色譜儀主要的組成部件為高壓輸液泵、進(jìn)樣裝置、色譜柱、檢測(cè)器和色譜數(shù)據(jù)處理裝置。1.高壓輸液泵由于高效液相色譜所使用的色譜柱一般裝填小于10μm的固定相顆粒,故對(duì)流動(dòng)相有較大的阻力,所以對(duì)于泵的耐壓有一定的要求。除此之外,對(duì)于輸液泵還有泵體材料耐化學(xué)腐蝕、輸出流量范圍寬、輸出流量穩(wěn)定等要求。高壓輸液泵可以分為恒壓泵和恒流泵兩大類。恒壓泵是指輸出恒定壓力的泵,當(dāng)系統(tǒng)阻力不變時(shí)可以保持恒定流量,但系統(tǒng)阻力發(fā)生變化時(shí),就會(huì)影響到系統(tǒng)流量穩(wěn)定,因此現(xiàn)在基本已不使用。恒流泵是指可輸出恒定體積流量的泵,又分為注射型泵和往復(fù)式柱塞泵兩類。注射型泵由于其工作過程中需停流吸液以及價(jià)格昂貴等原因,目前基本不用于高效液相色譜儀中。往復(fù)式柱塞泵則可以提供低脈動(dòng)的連續(xù)穩(wěn)定液流,廣泛應(yīng)用于各種商品化儀器中,并衍生出了雙柱塞往復(fù)式并聯(lián)泵、雙柱塞往復(fù)式串聯(lián)泵、雙柱塞獨(dú)立驅(qū)動(dòng)的往復(fù)式串聯(lián)泵等多種設(shè)計(jì)。2.進(jìn)樣裝置在HPLC分析中由于使用了高效顆粒填料和高壓的流動(dòng)相,因而對(duì)樣品的進(jìn)樣方式要求提高,需要使樣品在進(jìn)入色譜柱頭時(shí)準(zhǔn)確地注人其上端填料的中心,形成集中的一點(diǎn),以保證擴(kuò)散效應(yīng)影響降到最低。為實(shí)現(xiàn)以上要求有兩種設(shè)計(jì):停流進(jìn)樣和六通閥進(jìn)樣,但現(xiàn)在停流進(jìn)樣技術(shù)已經(jīng)完全被簡(jiǎn)單易用的六通閥進(jìn)樣方式所取代。3.色譜柱色譜柱一般使用內(nèi)壁拋光的直型不銹鋼管作為柱管以獲得高柱效。當(dāng)使用粗內(nèi)徑短柱和細(xì)內(nèi)徑色潛柱時(shí),需要注意柱外效應(yīng)所引起的色譜峰展寬,應(yīng)該盡量縮短進(jìn)樣器至檢測(cè)器之間的連接管路,以獲得更小的柱外死體積。HPLC色譜柱裝填的固定相,其基體材料多為全多孔球形或無定形的硅膠顆粒,在高壓下使用勻漿裝柱法裝填,并在色譜柱兩端使用多孔不銹鋼燒結(jié)材料的過濾片以阻擋流動(dòng)相中的微小機(jī)械雜質(zhì)進(jìn)入,并防止固定相流失。4.檢測(cè)器檢測(cè)器主要用于檢測(cè)經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度變化。常用的檢測(cè)器為紫外/可見光檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等。5.色譜數(shù)據(jù)處理裝置高效液相色譜的分析結(jié)果數(shù)據(jù)現(xiàn)已廣泛使用色譜數(shù)據(jù)工作站來記錄和處理。色譜工作站基于微型計(jì)算機(jī)的硬件,可以實(shí)現(xiàn)如下功能:(1) 儀器操作參數(shù)的控制功能——色譜儀的所有可控參數(shù),均可預(yù)先設(shè)定并保存記錄,在運(yùn)行樣品時(shí)自動(dòng)調(diào)用并傳輸至儀器。(2) 數(shù)據(jù)采集和處理功能——可通過計(jì)算機(jī)和儀器之間的數(shù)據(jù)傳輸接口自動(dòng)采集色譜數(shù)據(jù)。并根據(jù)指定處理參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,提供色譜圖的相關(guān)積分?jǐn)?shù)據(jù),還可以選擇不同的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算方式來對(duì)樣品自動(dòng)進(jìn)行計(jì)算,得到定性或定量的結(jié)果。還具有計(jì)算柱效、繪制工作曲線等其他功能。

5,elisa的基本原理

ELISA的原理:ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,又保留酶的活性。進(jìn)行檢測(cè)時(shí),樣品中的受檢物質(zhì)(抗原或抗體)與固定的抗體或抗原結(jié)合。通過洗板除去非結(jié)合物,再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,此時(shí),能固定下來的酶量與樣品中被檢物質(zhì)的量相關(guān)。通過加入與酶反應(yīng)的底物后顯色,根據(jù)顏色的深淺可以判斷樣品中物質(zhì)的含量,進(jìn)行定性或定量的分析。由于酶的催化效率很高,間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,使測(cè)定方法達(dá)到很高的靈敏度。1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzymelinkedimmunosorbentassay, ELISA)用于IgG定量測(cè)定的文章,使得1966年用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測(cè)定方法。ELISA可用于測(cè)定抗原,也可用于測(cè)定抗體。這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑:1. 固相的抗原或抗體;2. 酶標(biāo)記的抗原或抗體;3. 酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀及檢測(cè)的具備條件,可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。
ELISA基本原理是抗原或抗體預(yù)先結(jié)合到某種固相載體表面;測(cè)定時(shí),將待測(cè)樣品(含待測(cè)抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按一定程序與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物;反應(yīng)終止時(shí),固相載體上酶標(biāo)抗原或抗體被結(jié)合量(免疫復(fù)合物)與待測(cè)標(biāo)本中待檢抗體或抗原的量呈一定比例;經(jīng)洗滌去除反應(yīng)液中其他物質(zhì),加入底物進(jìn)行顯色,最后通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測(cè)物質(zhì)含量。
eilsa主要是基于抗原或抗體能吸附至固相載體的表面并保持其免疫活性,抗原或抗體與酶形成的酶結(jié)合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。在測(cè)定時(shí),把受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng),用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開,最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一定的比例,加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。
ELISA即酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn),原理:包被抗體或抗原,然后加入待檢物,里面的抗原或抗體與包被板上產(chǎn)生特異性結(jié)合,再通過酶來催化顯色反應(yīng),顯色反應(yīng)后的吸光度OD值與酶的量相關(guān),而酶的量與待檢物相關(guān),故可以檢測(cè)待檢物含量。具體方法有直接法,間接法,競(jìng)爭(zhēng)法,捕獲法,阻斷法等。

6,液相和氣相色譜儀的原理和組成部件是什么

液相色譜儀: 色譜分離基本原理:在色譜法中存在兩相,一相是固定不動(dòng)的,我們把它叫做固定相;另一相則不斷流過固定相,我們把它叫做流動(dòng)相。 色譜法的分離原理就是利用待分離的各種物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)、吸附能力等親和能力的不同來進(jìn)行分離的。 使用外力使含有樣品的流動(dòng)相(氣體、液體)通過一固定于柱中或平板上、與流動(dòng)相互不相溶的固定相表面。當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí),混合物中的各組分與固定相發(fā)生相互作用。 由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異,與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同,隨著流動(dòng)相的移動(dòng),混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡,使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同,從而按一定次序由固定相中先后流出。與適當(dāng)?shù)闹髾z測(cè)方法結(jié)合,實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測(cè)。 高效液相色譜儀可分為“高壓輸液泵”、“色譜柱”、“進(jìn)樣器”、“檢測(cè)器”、“餾分收集器”以及“數(shù)據(jù)獲取與處理系統(tǒng)”等部分。 高壓輸液泵 功能 驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相和樣品通過色譜分離柱和檢測(cè)系統(tǒng); 性能要求 流量穩(wěn)定(±1),耐高壓(30~60Mpa),耐各種流動(dòng)相:例如:有機(jī)溶劑、水和緩沖液; 種類 往復(fù)泵和隔膜泵。 色譜柱 功能 分離樣品中的各個(gè)物質(zhì); 尺寸 10~30cm長(zhǎng),2~5mm內(nèi)徑的內(nèi)壁拋光的不銹鋼管柱; 填料粒度 5 ~ 10μm ,高效微粒固定相; 進(jìn)樣器 功能 將待分析樣品引入色譜系統(tǒng); 種類 ①注射器,10Mpa以下,1~10μm微量注射器進(jìn)樣 ②停流進(jìn)樣 ③閥進(jìn)樣,常用、較 理想、體積可變,可固定 ④自動(dòng)進(jìn)樣器,有利于重復(fù)操作,實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化 檢測(cè)器 功能 將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉(zhuǎn)化為光學(xué)或電學(xué)信號(hào); 分類 ①示差折光化學(xué)檢測(cè)器 ②紫外吸收檢測(cè)器 ③紫外一可同分光光度檢測(cè)器 ④二極管陣列紫外檢測(cè)器 ⑤熒光檢測(cè)器 ⑥電化學(xué)檢測(cè)器 餾分收集器 功能 如果所進(jìn)行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析,而是為了做其它波譜鑒定,或獲取少量試驗(yàn)樣品的小型制備,餾分收集是必要的; 方法 ①手工,少數(shù)幾個(gè)餾分,手續(xù)麻煩,易出差錯(cuò)。 ②餾分收集器收集,比較理想,微機(jī)控制操作準(zhǔn)確。 數(shù)據(jù)獲取和處理系統(tǒng) 功能 把檢測(cè)器檢測(cè)到的信號(hào)顯示出來 氣相色譜儀: GC主要是利用物質(zhì)的沸點(diǎn)、極性及吸附性質(zhì)的差異來實(shí)現(xiàn)混合物的分離,其過程如圖氣相分析流程圖所示。 待分析樣品在汽化室汽化后被惰性氣體(即載氣,也叫流動(dòng)相)帶入色譜柱,柱內(nèi)含有液體或固體流動(dòng)相,由于樣品中各組分的沸點(diǎn)、極性或吸附性能不同,每種組分都傾向于在流動(dòng)相和固定相之間形成分配或吸附平衡。但由于載氣是流動(dòng)的,這種平衡實(shí)際上很難建立起來。也正是由于載氣的流動(dòng),使樣品組分在運(yùn)動(dòng)中進(jìn)行反復(fù)多次的分配或吸附/解吸附,結(jié)果是在載氣中濃度大的組分先流出色譜柱,而在固定相中分配濃度大的組分后流出。當(dāng)組分流出色譜柱后,立即進(jìn)入檢測(cè)器。檢測(cè)器能夠?qū)悠方M分的與否轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào),而電信號(hào)的大小與被測(cè)組分的量或濃度成正比。當(dāng)將這些信號(hào)放大并記錄下來時(shí),就是氣相色譜圖了。 (1) 載氣系統(tǒng) 氣相色譜儀中的氣路是一個(gè)載氣連續(xù)運(yùn)行的密閉管路系統(tǒng)。整個(gè)載氣系統(tǒng)要求載氣純凈、密閉性好、流速穩(wěn)定及流速測(cè)量準(zhǔn)確。 (2)進(jìn)樣系統(tǒng) 進(jìn)樣就是把氣體或液體樣品速而定量地加到色譜柱上端。 (3)分離系統(tǒng) 分離系統(tǒng)的核心是色譜柱,它的作用是將多組分樣品分離為單個(gè)組分。色譜柱分為填充柱和毛細(xì)管柱兩類。 (4)檢測(cè)系統(tǒng) 檢測(cè)器的作用是把被色譜柱分離的樣品組分根據(jù)其特性和含量轉(zhuǎn)化成電信號(hào),經(jīng)放大后,由記錄儀記錄成色譜圖。 (5)信號(hào)記錄或微機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 近年來氣相色譜儀主要采用色 譜數(shù)據(jù)處理機(jī)。色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)可打印記錄色譜圖,并能在同一張記錄紙上打印出處理后的結(jié)果,如保留時(shí)間、被測(cè)組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)等。 (6)溫度控制系統(tǒng) 用于控制和測(cè)量色譜柱、檢測(cè)器、氣化室溫度,是氣相色譜儀的重要組成部分。
文章TAG:高效液相色譜儀原理HPLCMSMS原理

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